液相色譜的定性定量分析

一、定性分析

在高效液相色譜中，常用的定性分析有下列五種方法。

1、利用已知標準樣定性

由于每一種化合物在特定的色譜條件下有其特定的保留值，如果在相同的色譜條件下，被測物與標樣的保留值相同，則可初步認為被測物與標樣相同。

2、利用紫外和熒光光譜定性

由于不同的化合物有其不同的紫外吸收或熒光光譜，對檢測池中的待檢樣品進行全波長（180～800nm）掃描，得到紫外可見光或熒光光譜圖；再用相應標準品，按同樣方法處理，也得到一個光譜圖，比較這兩張圖譜，即可鑒別該樣品是否與標準品相同。對于某些有特征光譜圖的化合物，也可以與所發(fā)的標準圖譜來比較以進行定性。

3、收集柱后流出組分，再用其他化學或物理方法定性

液相色譜常用化學檢測器，被測物經過檢測器后不受破壞，所以可以收集各組分，然后再用紅外光譜、質譜、核磁共振等方法進行鑒定。

4、HPLC 指紋圖譜分析法

HPLC 指紋圖譜分析法是指紋圖譜與 HPLC 相結合的一種分析方法，目前已成為中藥質量控制的方法，適用于中藥復雜成分的分離、分析和指紋圖譜的建立。在食品上主要用于天然成分的分析。被分離、分析物質預處理后用HPLC 測定出色譜峰，經過計算機庫存信號的檢索及對質譜圖的解析，對所含成分做出定性鑒定。

5、建立液相色譜定性方法

可根據以下幾點，建立合理的液相色譜分析方法：選擇合適的分析樣品的液相色譜方法；選擇合適的柱子；選擇合適的k（峰容量因子）的條件；確定良好的峰位（α）；選擇良好的柱條件（最佳 N 值）。

根據樣品的情況，如分子量是大于2000還是小于2000，樣品是溶于水還是不溶于水，確定選擇何種液相方法。

選擇溶劑強度配成適宜的流動相，以得到理想的k，使k盡量在1～10的范圍內（特殊情況也允許0.5<k<20）。溶劑的黏度也很重要，一般黏度要小于2×10-3Pa·s。

二、定量分析

在高效液相色譜分析中常用的定量分析方法有外標法和內標法。

1、外標法

外標法是以被測化合物的純品或已知其含量的標樣作為標準品，配成一定濃度的標準系列溶液，注入色譜儀，得到的響應值（峰高或峰面積）與進樣量在一定范圍內成正比。用標樣濃度對響應值繪制標準曲線或計算回歸方程，然后用被測物的響應值求出被測物的量。

2、內標法

內標法是在樣品中加入一定量的某一物質作為內標進行的色譜分析，被測物的響應值與內標物的響應值之比是恒定的，此比值不隨進樣體積或操作期間所配制的溶液濃度的變化而變化，因此可得到較準確的分析結果。

具體操作步驟如下。

（1）先準確稱取被測組分 a 的標樣 Wa內標物，加入一定量溶劑混合，即得混合標樣。取任意體積（μL）注入色譜儀，得色譜峰面積Aa（被測組分a標樣峰面積）及峰面積As（內標物峰面積），用下式計算相對響應因子Sa。

（2）稱取被測物W，然后加入準確稱重的內標物W's，加入一定體積的溶劑混合。取任意體積（μL）注入色譜儀，測得被測組分a的峰面積A'a，內標物峰面積為A's。按下式計算被測物中 a 組分的質量W'a。

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